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从新冠疫情看分子诊断POCT的发展
 投资部          2020-03-19

疾病检测技术一直处于高速发展的过程中,越来越多的手段使人类对疾病的诊断日渐精准。但是,准确率更高的检测手段通常意味着更高的成本、更长的时间、更繁复且条件苛刻的诊断流程,这使得临床往往在面对高度传染性疾病时陷入两难的境地,即大规模确诊病人的紧迫性与捉襟见肘的高端检测资源相冲突。在此次新冠疫情面前,常见检测手段的局限性就暴露无遗,由于诊断“金标准”分子诊断对试剂、设备、场地、操作人员要求都很高,检测集中在三级以上医院及各大三方检测中心中,资源非常有限,最终在检测能力不足以快速识别所有患者的情况下,为切断传染链只能对所有人采取停工、停学等手段,极大的影响到日常经济活动和生活。同样的,世界医学最发达的日本、美国等国家地区也无法摆脱检测试剂不足、检测成本高昂等问题。如果能有兼顾高准确率、低成本、操作简易、用时短等特点,适合基层医疗机构使用的检测手段,无疑将大大提高防疫效率。

实际上,分子诊断方法不仅仅在提高准确度、通量等方向进步,也在努力朝着小型化、自动化、高速化、简易化等方向发展,推动分子诊断实现去中心化的目的,普惠基层医疗。在这其中,得益于微流控、恒温扩增等新技术的使用,已经诞生了一批符合基层条件的分子诊断POCT产品,包括此次疫情中也催生了不少相关产品,值得我们深入探讨和研究。

 

一.分子诊断的必要性


传染性疾病的诊断方法有培养法、免疫检验、分子检验、质谱检验等,综合效率、成本、准确率、使用难度等各方面因素考量,免疫检测和分子检测是当前最为主要的两种诊断方法。

 

资料来源:公开资料、创璟资本整理

 

此次新冠肺炎的诊断也以分子诊断和免疫检测为标准。根据《新冠病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第七版)》(“诊疗方案”),新冠肺炎患者有3种确诊方法:“1. 实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性;2. 病毒基因测序,与已知的新型冠状病毒高度同源;3. 血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性;血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由隐性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高”。其中前2种方法为分子诊断,第3种为免疫检验。

值得注意的是,第3种检测方法是在最新一版诊疗方案中才被加入,分子诊断的权威性则是在一开始就被确立。免疫诊断虽然有成本低、操作难度低、检测速度快等优势,天然适合普及基层使用,但其对检测有明显的窗口期要求,必须在患者产生抗体后才能有效,这又与传染病确诊的紧迫性相矛盾。大部分传染病在发病初期的传染性最强,但免疫诊断在此时又难以确诊,容易错失防疫的重要时机。相比之下,分子诊断虽然成本高、操作要求高,但窗口期要求远远低于免疫检验,在面临重大传染性疾病时,及时性和准确率才是最重要的考虑因素,并没有其他更好的选择。

分子诊断又可被分为核酸扩增技术、基因芯片、基因测序等多类技术,其中以聚合酶链式反应(PCR)为主的核酸扩增技术由于敏感性、特异性表现优秀,操作相对简单且成本低,性价比最高,成为当前最普及的核酸诊断方法。而基因芯片、基因测序则由于技术难度大、设备投入大、试剂成本过高等原因,当前还不具备大规模使用的基础。在此次疫情中,实时荧光PCR技术就成为使用量最大的诊断方法。

 

资料来源:公开资料、创璟资本整理

 

 

二.PCR的局限性有突破空间

 

虽然实时荧光PCR技术成为此次疫情中最为主要的确诊手段,但其本身具有的局限性也在阻碍着检验产能的提高,造成疫情初始时检验资源严重不足的局面。

首先,PCR操作流程繁琐,导致检验效率低且用时过长。简单而言,PCR需要通过反复升降温,循环“加温-退火-延伸”步骤进行扩增。扩增通常需要1-2个小时的时间,加上前期样本处理、提取的流程,总体操作时间往往要超过3个小时,效率低下。并且,上述繁琐的流程也使得PCR检验对操作人员要求较高,基层并无足够数量的相关人员配备。

其次,PCR对操作场地有严格要求。由于PCR反应过程中不断进行升温、降温,样本液体蒸发后冷凝,容易在空气中形成携带大量样本DNA的气溶胶,进而污染其他样品。因此,PCR检验需要专门的PCR实验室,将试剂配制、标本处理、扩增和分析等操作流程区分开,并通过控制空气流动方向以保证空气清洁度。一个PCR实验室往往需要数百万元的资金投入,这是基层无法负担的,因此我国PCR检测主要集中在三级以上医院和三方大型检测中心中。

 

图片来源:公开网络、创璟资本整理

 

从问题出发,要解决核酸检验难以在基层普及的问题,简化操作流程、实现操作的全自动化、设备的全集成化势在必行。可喜的是,恒温扩增、微流控等新技术的使用,使突破这些局限因素成为可能性。

恒温扩增是一种建立在PCR基础上开发的核酸扩增手段。通过加入特殊设计的酶和引物,恒温扩增无需反复升降温,只需要一个温度即可完成扩增。相比PCR,恒温扩增不仅仅是操作步骤更简单,其对仪器设备的要求很低,反应速度被大大缩短至1小时以内。从20世纪90年代恒温扩增技术被提出后,截止当前全世界共有十多种常见的恒温扩增技术,其原理不尽相同,其中使用量最大的包括环介导恒温扩增法(LAMP)、实时荧光核酸恒温扩增法(SAT)等。

 

数据来源:公开网络、创璟资本整理

 

微流控是一种通过微纳加工方式,在芯片上构建出各种储液池和相互连接的微通道系统,并通过精密的控制,使得加入的样品或其他加入的液体能沿着既定路线、流速等条件,完成检测所需的各种反应步骤,相当于将实验室中的样品制备、反应、分离、检测等步骤集成在芯片之上(对于微流控的详细介绍,可以参考我们过去的文章《微流控芯片在体外诊断中的产业化展望》

 

图片来源:汶颢股份、创璟资本整理

 

通过上述两大类技术的应用,使分子诊断POCT产品成为可能。

一方面,扩增的流程被简化。由于技术原理限制,PCR的升降温固有流程难以改变,但是,无需热变的恒温扩增技术只需要一个温度即可完成扩增反应,大大缩短检验时间。除此之外,由于PCR的扩增速度与升降温速度和精度正相关,而升降温速度和精度又与反应体积负相关,使用微流控技术能够减少反应体积,从而变相的加快扩增速度。

另一方面,全自动化、全集成的检验操作正在被逐步实现。通过集成样本处理、核酸提取、扩增、检测所有步骤,再加上全自动化的操作体验,不仅仅使得操作流程更加简易,还能摒除人为因素的干扰,提升结果准确率,好处显而易见。但是,在生化、免疫等其他各类检测手段都已经实现全自动化的今天,核酸检验还迟迟未能实现全自动化,最主要的原因是核酸检验灵敏度过高,要求各模块密闭,对设备的设计要求很高;同时PCR又需要反复升降温,严苛的温度环境对本就精密性要求极高的设备进一步提出挑战,因此全自动PCR产品开发难度极高。恒温扩增和微流控技术的辅助,一定程度上削弱了上述要求的影响。恒温扩增技术不需要升降温环节,流程更为简单,对反应条件和设备要求有所降低;而微流控技术则实现各个反应模块的封闭化,解决了交叉污染的问题。

 

 

三.恒温扩增与微流控技术的应用

 

基于恒温扩增、微流控等技术,有众多分子诊断POCT产品已被开发出来。在微流控领域,国外Cepheid、BioFire、IQuum等公司的产品已经在大放异彩,国内也有博晖创新等知名企业参与其中。而在恒温扩增领域,目前仍处于早期发展阶段,国内外都没有特别成熟的应用出现,但在近期新冠疫情中恒温扩增技术被权威专家、单位反复提及,博奥生物通过新冠应急审批通道拿下了呼吸道病毒恒温扩增诊断试剂注册证,证明该领域值得深入关注。

 

◾Cepheid公司GeneXpert系列

Cepheid所开发的GeneXpert是全球首个集成样品制备、核酸扩增和检验步骤的全自动分子诊断产品,也是当前全球分子诊断POCT领域的龙头,产品涵盖急性传染病、生殖健康、肿瘤等范畴的诊断。该产品核心仍然是常规PCR技术,但是通过微流控芯片,GeneXpert将所有检测环节所需的试剂集成在小小的试剂盒中,并通过操控试剂盒内的样本不断转移、与不同的试剂先后结合,最终实现样品裂解、核酸纯化、扩增、分析集成于一体,使得PCR检验变成一键化操作。

作为分子诊断POCT的龙头, Cepheid在2015年即实现了5.4亿美元的收入,并在2016年被器械巨头以40亿美元高额对价收购,足以证明GeneXpert的潜力。但是,GeneXpert虽然性能表现优异,但也并非没有缺点。由于其并没有改变PCR技术原理的本质,只是通过精密的机械设计实现检验的集成化。这一方面造成产品无法省略检验繁琐的流程(虽然自动化了),总体检测时间达到2.5-3个小时,并没有比常规PCR快太多;另一方面,过于精密的产品对于环境的要求仍然很高,任何对设备内部微小的污染都会造成检验失败,同时对微小流体的操控也有各种故障的隐患(如气泡、残留、倒流等)。最后,GeneXpert最大的问题在于产品成本过高,以其在中国近百万的设备定价、近千元的试剂定价来看,基层医疗难以负荷。

 

图片来源:公开网络、创璟资本整理

 

◾BioFire公司Filmarray系列

于2013年被生物梅里埃以4.5亿美元所收购的BioFire,其Filmarray产品是除GeneXpert外全自动微流控PCR领域另一个极富声誉的产品,产品涵盖呼吸道、血液、胃肠道、脑膜炎等多种感染性疾病。与GeneXpert采用常规CPR技术不同的是,Filmarray采用的是多重巢式PCR技术,检测时间缩短至1个多小时,并且不仅仅特异性、敏感性高于常规PCR技术,还能够在一次检测中检测多种致病菌。但是缺陷在于Filmarray只能做定性检测,且通量低(单机一次一个样本),成本又相对更高,因此总体市场普及率落后于GeneXpert。

 

图片来源:公开网络、创璟资本整理

 

◾IQuum公司Cobas Liat PCR系列

被罗氏在2014年以4.5亿美元所收购的IQuum公司,其开发的Cobas Liat PCR系列采用了非常规的微流控结构,使得设备结构进一步被简化,操作也更为简单。其打造的微流控芯片形似试管,并被分成多个独立区段,各自包含每个检测环节所需的试剂、反应物。样本被设备提供的压力推动,经过试管内不同区间,逐步实现反应。同时,该设备不需反复升降温,而是同时提供三个不同温度的区段,让样本在不同温度区段来回移动,从而缩短了设备反复升降温所需的时间,使得检测速度大幅缩短至半小时左右。但是与Filmarray类似的,该产品通量低(一次一个样本),且仅能定性而无法定量。

 

图片来源:罗氏Cobas liat、创璟资本整理

 

◾博奥生物晶芯RTisochip系列

博奥生物的晶芯RTisochip恒温扩增微流控芯片核酸分析仪是国内首个获得NMPA注册证的恒温扩增检测设备,其针对呼吸道病原菌开发了一系列产品,并在近期通过新冠肺炎紧急审批通道,拿到了包括新冠病毒在内的19种呼吸道常见病毒联检试剂盒。

晶芯开创性的将微流控与LAMP恒温扩增技术结合在一起,综合两种技术优势,相比单纯微流控产品检测速度更快,50分钟内即可出结果;相比单纯恒温扩增产品又有更高的灵敏度、准确性,样品用量少,并且利用微流控分区进行多通道并行检验,能够一次性实现多个指标的检测。但是,基于LAMP恒温扩增技术虽然有步骤简单、扩增高效、高特异性等优势,但是引物设计难度过大、假阳性较高等问题,晶芯除了呼吸道外一直未能开拓新的疾病市场,想必也与此有关。此外,晶芯仅仅集成了扩增、检测流程,前序核酸提取步骤得依靠其他设备或人工,并没有实现完全 “样本进、结果出”的集成化和全自动化。

 

图片来源:博奥生物、创璟资本整理

 

◾仁度生物AutoSAT全自动核酸检测分析系统

仁度生物的AutoSAT全自动核酸检测分析系统基于SAT RNA恒温扩增方法所开发,于2019年获得NMPA注册证,是国内第一个引入全自动核酸检测流水线概念的设备,能同时进行4项检测。并且,与其他分子诊断POCT相对较低的通量而言,该产品可一次性放置80个样本并实现连续上样。目前,AutoSAT产品涵盖了生殖健康、呼吸道、肠道、血液等传染性疾病,是国内可检验类别最多的恒温扩增产品。

虽然AutoSAT展现出其大通量的差异性优势,但通量大可能是优势,也可能会造成公司产品定位不清的问题。恒温扩增技术最大的优势并非是和三级医院中的qPCR做竞争,而是填补基层分子诊断的空缺。基层的需求一方面是要求操作够简单,另一方面则要求仪器和试剂的成本足够低,反而对通量的要求并不是那么高。因此,AutoSAT的高通量优势,在基层市场中并不能展现太强的竞争力,反而为了实现高通量造成设备产品价格过高,基层难以负担。在检测时间方面,对于多样本检测,AutoSAT需要一个半小时才能出第一个结果,后续每10分钟出6个结果,8小时通量220个样品,24小时通量700个样本。虽然在通量大了以后,样本的平均用时很短,但明显看出该设计不利于基层少量样本检测使用。由此可见,AutoSAT并非是未基层设计的产品。除了通量和效率的取舍问题外,SAT技术还因循环过程过于复杂,需重复加入多种酶,试剂配方开发难度较大,造成试剂相对成本更高,也同样不利于基层使用。

 

图片来源:仁度生物、创璟资本整理

 

◾优思达生物全自动CPA核酸分析仪

优思达生物的全自动核酸分析仪基于其自主开发的“交叉引物恒温核酸扩增技术”(CPA)及试剂玻璃化技术,是国内恒温扩增领域自主化水平较高的产品。在此次疫情中,公司的冠状病毒恒温扩增试剂盒是继博奥生物之后,第二个通过应急审批通道获得NMPA注册证的恒温扩增检测产品。

虽然公司全自动核酸分析仪设备产品尚未获得注册证,无法得知详细的情况。但根据资料,其试剂产品结构设计与前述Cobas Liat PCR试剂管有些类似,试剂管被划分为多个区域,样本在加入试剂管后,通过设备引导试剂管内与样本DNA结合的磁珠,使样本DNA逐步与各层试剂进行反应、扩增和检测。通过简单化的结构设计,该产品不仅仅做到“样本进、结果出”的全自动化流程,并且检测速度极快,仅需15-30分钟左右即可完成检验。同时,设备采取模块化设计,单机可分开检测2个样本,符合基层样本随到随检的特性。除此之外,公司独家的试剂玻璃化技术,使得公司试剂产品能够在常温中保持稳定,而不需特别进行冷链运输和冷藏保存,也符合基层难以预估的使用环境。可以明显的看出,优思达的全自动恒温扩增产品是特别为满足基层需求所设计。

当然,优思达的产品也同样有一定的改进空间。其所依靠的CPA恒温扩增技术,与博奥生物所使用的LAMP技术相似,引物设计都有较高的难度,试剂开发难度大。此外,CPA技术要求的反应温度较高,由于全自动产品将所有试剂集合在同一试剂管中,高温一定程度上会影响到各个内容物的稳定性,造成反应混乱。优思达仍然有相当多的技术难题需要克服。

 

图片来源:优思达生物、创璟资本整理

 

除了上述介绍的公司和产品外,基于微流控领域还有Atlas Genetics开发的Atlas Genetics io系列产品(2016年A股上市公司万孚生物对该公司进行了1.25亿人民币的投资)、GenMark开发的ePlex系列产品、GenePOC公司开发的revogene系列产品,以及国内A股上市公司博晖创新开发的GenPlex系列产品、百康芯开发的iTotal系列产品等;基于恒温扩增领域的产品目前相对较少,有部分企业正处于初创阶段,产品形式尚不明朗。

 

 

四.总结

 

在各项检验技术中,分子诊断有着其他检验手段难以比拟的高敏感性和特异性,更凭借几乎无窗口期限制的优势,成为急性传染病检验的“金标准”。但是分子诊断一直以来是“高大上”的代言词,由于种种技术局限性,造成基层难以普及,也无法在大规模疫情发展下发挥应有的作用。所幸,得益于微流控、恒温扩增等各项新技术的发展并和分子诊断技术融合,普惠化的分子诊断产品逐步成为可能。我们也欣喜的看到,虽然分子诊断POCT行业仍然处于萌芽期当中,但此次抗疫并不缺乏分子诊断POCT产品的身影。虽然我国目前对于分子诊断POCT的监管态度尚不明朗,仍然有很多限制(例如PCR需要实验室才能使用的要求仍未放开),但此次面对新冠疫情检测资源严重不足的局面足以为相关部门敲响警钟,分子诊断POCT产品值得更多的扶持和鼓励,我们未来需要更好的武器去抗击传染病。

 

 



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