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细胞捕手——细胞分离技术探讨
 投资部          2020-01-29

自2009年以来,单细胞测序技术作为一种具备巨大潜力的前沿创新测序手段,受到了医学界的重视,被《Nature Methods》、《Science》等权威杂志列为最值得关注的技术领域。特别在2017年重要性不亚于“人类基因组计划”的“人类细胞谱计划”正式公布后,行业开始进入快速发展期,不论是在学术研究还是临床应用上均取得瞩目突破。作为市场热点,相信大家已经对单细胞测序足够熟悉,但却容易忽视测序环节中的前置细胞分离步骤的重要性。由于单细胞测序对样本条件的要求极高,细胞分离技术影响到后续测序的成功率,更影响到成本、测序时间等对商用化至关重要的因素。本文将就单细胞分离技术路径进行梳理,并结合实际临床表现进行对比,以供参考。

 

一、单细胞测序的背景

 

分子诊断发展50多年来,已经成为临床检验中不可或缺的一环。特别是近10年来随着二代测序技术的进步及使用成本下降,大量应用的涌现,实实在在的推动了临床检验往更早、更快、更精准的目标发展,医疗质量明显提高。但细胞个体存在较大差异,过往的基因测序手段,其检测的是样本细胞群体的平均状况,而非针对单一细胞。例如在肿瘤组织中,病灶中心的细胞、病灶周围的细胞在免疫特性、生长速度等各方面都存在明显差异,现有手段无法将其明显区分开来,只能得到平均水平。在这样模糊的信息结果指导下,临床治疗便“差之毫厘,谬以千里”。

因此,建立在上述痛点之上,对测序技术的创新思路逐步往针对单细胞的方向转移。单细胞测序以细胞个体为目标,测序流程与当前流行的二代测序雷同,通过细胞分离、遗传物质提取、扩增、测序与数据分析等流程进行。虽然测序方法论上没有太大的革新,但单细胞测序迟迟未能走向临床的一个重要原因就在于对单细胞的识别和分离难度大且成本过高。如果没能获得适合的单细胞样本,后面的测序、分析自然无从谈起。当前对于单细胞的分离技术仍处于探索期,业界尚未形成统一共识,技术方向也各有优缺。可以说如果有厂商能够开发出精准度高、操作简单、成本低的细胞分离技术,将在后续可见的激烈竞争中建立起较强的技术优势。

 

 

二、细胞分离技术类别

 

由于单细胞提供的信息量低于细胞群体,容错率低,对于细胞样本完整性的要求非常高。因此,细胞分离技术首先必须达到对细胞无损伤的要求。其次,出于临床使用的要求,细胞分离技术的操作难度和成本要达到合理水平,否则难以商业化,对临床治疗水平的提高也难有帮助。

实际上,在实验室中已经存在多种成熟的细胞分离技术,但大多耗时、耗力且准确率低下,只适合科研条件。但现有能够实现商业化的潜在技术或多或少都借鉴了传统手段,因此除了商业化技术外,我们也将简单阐述传统技术。

 

◾1.梯度稀释法

梯度稀释法是常见的一类微小样本分离技术,其原理简单、成本低,成为实验室中科研操作的首选方法之一。该方法原理是通过对细胞悬浊液反复进行取样稀释,理论上当稀释次数足够多,样品中的细胞群就能够被分散开,最终各个个体细胞分布在不同的悬浊液中,也就便于进一步观察或操作。

梯度稀释法有明显缺点,一是操作过于繁琐,需要花费大量的时间和人力,效率太低;另一方面,稀释过程中很容易丢失目标细胞。这些缺点使其完全不适合临床上使用,甚至在实验室中也被逐步淘汰。

 

 

2.显微操作技术

显微操作技术,顾名思义即是在显微镜下通过对细胞群观察,再利用吸管对目标细胞进行吸取并转移至容器中。该方法原理简单直观,能够直接对目标细胞进行分离操作,但缺点同梯度稀释法一样,该方法依靠人工操作,观察识别目标细胞耗时长、难度大,且吸取分离的过程中容易对细胞造成损伤。

德国公司Eppendorf的显微操作系统Transferman系列及瑞士公司MMI的单细胞挑选系统CellEctor系列是现在技术最先进且国内普及率最高的显微操作产品之一,但仍然依靠人工识别和操作,核心痛点依然无法解决。因此,对于该产品的定位依然是在实验室科研使用,Eppendorf并无将其推往临床上的打算。

 

 

虽然现有显微操作技术无法应用于临床,但其原理最为直接,当前有许多技术研究方向均是建立在此技术上,进一步利用机器视觉识别、机械臂吸取等手段提高操作的自动化水平、降低人为因素影响,有望能够克服现有技术的缺陷。


3.激光捕获显微切割技术(LCM)

激光捕获显微切割技术是利用高精度的激光对样本进行切割,以获得目标细胞。简单而言,操作者通过显微镜观察处理好的样本组织切片,确定好目标细胞位置,发射激光脉冲融化预先覆盖在样本之上的EVA膜,EVA膜会在指定位置迅速融化包裹目标细胞并凝固,最终实现目标细胞与组织分离的。

相比于显微镜操作技术,LCM在一定程度上提高了自动化水平,并且提高了捕获的精度和速度,也不易对细胞造成损伤,保证了样本的完整性。因此,LCM在单细胞捕捉上的使用率处于领先位置,国内常见的有MMI的CellCut、Thermo Fisher的Arcturus Cellect、莱卡的LMD等产品,竞争激烈。

 

 

虽说LCM的优势明显,但同样难以在临床上大规模应用,主要问题在于对目标细胞的识别依然是人工操作,并且切割过程中难以做到对目标细胞进行完整的单一分离,容易带入周边其他细胞的部分组织,造成样本的污染,从而影响到后续的操作。


4.荧光激活细胞分选术(FACS)

荧光激活细胞分选术对比上述技术,由于其自动化程度最高,是最适合商业化的细胞分选技术。FACS依托的是流式细胞仪,根据不同细胞群的特异性标志、光散射特征等,让细胞逐个通过激光束,利用激光束激发细胞荧光,并根据荧光的不同对细胞赋予不同的电荷,从而在电磁场的作用下将其归类分选到不同的区域中,实现细胞分类。

 

 

FACS最大的优势在于其自动化、标准化程度高,没有太多人工干预的环节,通量大、速度快且灵敏度远高于人力肉眼识别。因此,在早期的单细胞测序研究中,FACS被认为是最有潜力的细胞捕捉技术。但随着研究的进一步深入,FACS的缺陷也逐步暴露,由于其技术原理的限制,要求目标细胞群体的量要达到一定程度,但当前需要解决的往往是低丰度细胞的捕捉问题,例如循环肿瘤细胞每10ml血液中仅有几个至几十个,使用FACS无法有效的将其完整分离开来,也无法对单个细胞进行跟踪;且细胞在挑选、分离的过程中,也容易对细胞造成损伤。因此,近年来更多厂商选择开发新的技术对FACS进行替代。


◾5.微流控技术

以微流控技术为基础的各类复合型创新方法是现在各大单细胞测序厂商重点发力的方向。微流控是一个宽泛的概念,其指将化学或生物样品的采集、稀释、反应、制备、检测等操作集成在一个微型化的平台甚至是芯片上,被广泛应用于检验科学的技术创新上。

针对单细胞捕捉,微流控技术可分为通过物理结构设计进行捕获的液滴微流控及流体力学微流控两种商业化程度最高的捕获方法,以及利用光、电、声、磁等外力驱动的捕获方法。


✔液滴微流控

液滴微流控技术是利用结构设计,将样本中每个细胞包裹在液滴当中,并将每个液滴作为独立体进行细胞裂解、PCR、测序等手段,从而获得每个独立细胞的表达信息。当前单细胞测序领域最为知名、体量最大且进展最靠前的10X Genomics即是使用了液滴微流控技术。其测序平台设计了双十字通道,细胞在经过通道时被添加了包含引物的微球,并被油滴包裹形成了独立的液滴,随后每个液滴再进行独立的反应,裂解释放mRNA,通过逆转录产生用于测序的cDNA;后续再进一步吸走油层,进行文库构建和测序,从而获得各个细胞的独立表达信息。

 

 

液滴微流控的优势明显,其捕捉效率高,成本相对较低。从数据进行比较,10X Genomics的产品捕捉率也是最高的,并且实现了高程度的自动化,具备大规模商业化普及的基础条件。


✔流体力学捕获法

流体力学捕捉法是利用物理结构设置障碍,将细胞混悬液中的单个细胞分离开来,从而能够对个体细胞进行操作处理。近年来与10X Genomics在单细胞测序上一争高下的BD公司采用了该技术路径,其开发与单细胞尺寸相当的凹槽结构阵列芯片(有20多万个微孔),当细胞混悬液流经芯片时,细胞将落入凹槽中,并与反应物产生反应。除了利用凹槽外,还有通过设计挡板对细胞进行拦截等手段。

 

 

流体力学捕获的方法通量大,并且能锁定目标细胞进行持续的跟踪观察。同时,根据BD Rhapsody自身宣传,微孔凹槽技术能避免如10X Genomics液滴微流控技术存在的碰撞影响捕获效率的问题,捕捉成功率更高。但是,该方法的缺陷在于芯片的加工难度较大,多数厂商选择与半导体芯片类似的蚀刻方法进行加工,成本高;并且在样本混悬液流过微流控芯片时容易造成交叉污染,影响后续的分析。


✔外力驱动捕捉法

除了上述常见手段外,还有包括单光束激光捕获、介电电泳捕获、声波捕获、磁捕获等方法被应用在单细胞捕捉上,这些方法各有优势,但缺陷也同样比较明显,因此商业化潜力和使用率不如上述2种微流控方法。

单光束激光捕获法,又称为光镊技术。其利用光对物体的作用力,通过高度会聚的激光束形成三维势阱,微小物体受光场作用会被束缚在光阱处,并随着光阱移动。光镊技术已经非常成熟,被广泛应用于对纳米至微米级微小物体的操纵和捕获当中。对于单细胞捕获而言,其不仅仅能捕捉单个细胞(微米级),甚至还能利用光的无伤穿透性对细胞内纳米级的物质进行操控。但是,该手段的缺陷就在于依靠人工,且光镊设备使用条件苛刻、价格昂贵,通量过低也不适合大规模的应用。

介电电泳捕获法,是一种成本较低且操作方法丰富的微小物体操纵手段。在传统微流控技术中,捕获细胞依靠的是目标细胞与反应物之间物理、化学作用产生的吸附力,但吸附力不一定能够精准的作用于目标细胞,非目标细胞也会混入其中,影响捕获样本的纯度。介电电泳捕获法的应用即是为了解决上述问题。通过建立非均匀电场,细胞被极化且受力产生定向移动,进入预先设定好的区域当中,分离的精准度有明显提高。但是,该方法针对不同的样本需要进行精密的电场参数设定,前期准备繁琐,尚无法大规模量产使用,目前仍在进行基础研究当中。

声波捕获法,是指在芯片上施加一定的声场,利用声波力驱动细胞移动。由于不同的细胞大小、质量、密度等物理性质存在差别,对声波的反应、作用均有所不同,因此在声场下可以明显的被分离成不同的群体。并且随着对声波的精细化控制及叠加多类声波的共同作用,还能进一步对细胞进行个体化的挑选。该方法相对其他外力驱动方法更为简单,制造成本也相对较低,且能够实现高通量的捕捉。但是,与介电电泳捕捉法类似,需要进行精细化的参数调整和设定,准备过于繁琐。

磁捕获法,是通过对磁珠表面覆盖抗体,使抗体与目标细胞产生特异性结合,再进一步用外部磁场将磁珠与目标细胞的结合体捕获分离。磁珠捕获法的捕获效率高,甚至要强于液滴微流控捕获法或流体力学捕获法,且生产、应用的难度和成本较低,唯一的缺陷在于对磁珠的设计难度高,抗体容易失活,造成捕获失效。

 

 

三、总结

 

本文介绍了5大类的单细胞捕捉技术,并就当前行业最前沿的微流控技术进行了更细致的分类介绍。从实际临床应用来看,梯度稀释法、显微分离方法均不适用,已经被淘汰;激光捕获显微切割技术和荧光激活细胞分选术已经具备了临床使用的基础条件,实现一定程度上的自动化,分选细胞更为精准,但还是难以应对单细胞测序对样本质量要求的快速提高;微流控技术则是最被寄予厚望的未来技术,行业前沿厂商都已经开发出成熟的、可被大规模普及的商业化产品。但这并不意味着单细胞捕捉技术已经完美,即使是10X Genomics、BD的产品依然存在不小的问题,各有其适用的领域,并且随着单细胞测序研究的进一步深入,现有产品是否能够跟上脚步还是个未知数。因此,想要在单细胞测序上判断出各个厂商的未来潜力,还需要进一步跟踪捕捉技术的发展。

 

 


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